Development of polymeric materials to inhibit bacterial quorum sensing

Bacterial infections are an increasing problem for human health. In fact, an increasing number of infections are caused by bacteria that are resistant to most antibiotics and their combinations. Therefore, the scientific community is currently searching for new solutions to fight bacteria and infectious diseases, without promoting antimicrobial resistance. One of the most promising strategies is the disruption or attenuation of bacterial Quorum Sensing (QS), a refined system that bacteria use to communicate. In a QS event, bacteria produce and release specific small chemicals, signal molecules - autoinducers (AIs) - into the environment. At the same time that bacterial population grows, the concentration of AIs in the bacterial environment increases. When a threshold concentration of AIs is reached, bacterial cells respond to it by altering their gene expression profile. AIs regulate gene expression as a function of cell population density. Phenotypes mediated by QS (QSphenotypes) include virulence factors, toxin production, antibiotic resistance and biofilm formation. In this work, two polymeric materials (linear polymers and molecularly imprinted nanoparticles) were developed and their ability to attenuate QS was evaluated. Both types of polymers should to be able to adsorb bacterial signal molecules, limiting their availability in the extracellular environment, with expected disruption of QS. Linear polymers were composed by one of two monomers (itaconic acid and methacrylic acid), which are known to possess strong interactions with the bacterial signal molecules. Molecularly imprinted polymer nanoparticles (MIP NPs) are particles with recognition capabilities for the analyte of interest. This ability is attained by including the target analyte at the synthesis stage. Vibrio fischeri and Aeromonas hydrophila were used as model species for the study. Both the linear polymers and MIP NPs, tested free in solutions and coated to surfaces, showed ability to disrupt QS by decreasing bioluminescence of V. fischeri and biofilm formation of A. hydrophila. No significant effect on bacterial growth was detected. The cytotoxicity of the two types of polymers to a fibroblast-like cell line (Vero cells) was also tested in order to evaluate their safety. The results showed that both the linear polymers and MIP NPs were not cytotoxic in the testing conditions. In conclusion, the results reported in this thesis, show that the polymers developed are a promising strategy to disrupt QS and reduce bacterial infection and resistance. In addition, due to their low toxicity, solubility and easy integration by surface coating, the polymers have potential for applications in scenarios where bacterial infection is a problem: medicine, pharmaceutical, food industry and in agriculture or aquaculture.

Agentes etiológicos de infecções urinárias em ambulatório

As infeções do trato urinário (ITU), depois das infeções respiratórias, são as mais comuns na comunidade, sendo a Escherichia coli o principal agente etiológico. Afeta predominantemente o sexo feminino e, anualmente, estima-se que ocorram em todo o Mundo cerca de 150 milhões de episódios de ITU, sendo responsável por 15% dos antibióticos prescritos em ambulatório. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os agentes etiológicos das ITU e determinar o seu padrão de resistência aos antimicrobianos na região litoral norte de Portugal, de modo a contribuir para o uso racional na terapêutica empírica. Foi realizado um estudo observacional, descritivo e transversal, sendo obtidos 80 967 resultados de uroculturas de um Laboratório de Análises Clínicas de prestação de serviços à comunidade, relativos ao período entre Abril de 2007 e Março de 2015. Registaram-se 13 541 bacteriúrias positivas (16,72%). Escherichia coli foi o microrganismo mais isolado (71,62%), seguida de Klebsiella pneumoniae (12,41%), Proteus mirabilis (7,84%), Enterococcus. faecalis (3,97%) e Pseudomonas aeruginosa (1,42%), tendo-se observado diferenças estatisticamente significativas entre sexos e idades. Verificou-se uma diminuição da resistência aos antimicrobianos a partir do ano de 2012. E. coli apresentou em 2015 a menor taxa de resistência respetivamente de 4,46% e 12,37% para a fosfomicina e nitrofurantoína. A combinação de amoxicilina+ácido clavulânico registou uma taxa de resistência superior a 20% (22,03%). O baixo nível de resistência à fosfomicina permite que este antibiótico se apresente como a opção terapêutica de primeira linha no tratamento empírico de ITU não complicada na mulher em ambulatório, pelo que, estes resultados permitem corroborar as indicações de 2011 da Direção Geral de Saúde sobre a substituição de fluoroquinolonas por fosfomicina.

Molecular diversity and transferability of integrons from wastewaters

Na evolução bacteriana, a capacidade de explorar novos ambientes e de responder a diferentes pressões selectivas deve-se principalmente à aquisição de novos genes por transferência horizontal. Integrões são elementos genéticos bacterianos que constituem sistemas naturais de captura e expressão de cassetes de genes, sendo um dos principais mecanismos bacterianos envolvidos na aquisição de resistências a antibióticos. Estudos recentes suportam a hipótese de que os ambientes naturais constituem importantes reservatórios de integrões e cassetes de genes. Uma vez que as águas residuais são descarregadas em receptores naturais, torna-se fundamental conhecer a presença e dispersão de integrões nestes ambientes, assim como a sua associação a outros elementos genéticos móveis e a genes de resistências a antibióticos. Neste trabalho, pretendeu-se avaliar a prevalência e diversidade de integrões em águas residuais de origem animal e doméstica, bem como a sua associação a plasmídeos conjugativos, usando metodologias dependentes e independentes do cultivo de microrganismos em laboratório. Os resultados obtidos sustentam assim a hipótese de que ambientes particularmente ricos em matéria orgânica, como é o caso das águas residuais, constituem ambientes propícios à presença de integrões e à ocorrência de transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos, embora a sua prevalência e diversidade seja influenciada pelo tipo de efluente em questão. A presença de integrões em estações de tratamento de águas residuais, e em especial nos efluentes tratados, constitui assim um factor preocupante, uma vez que tal contribui para a sua disseminação e dispersão por outros ecossistemas aquáticos, nomeadamente rios e mares. Os métodos utilizados permitiram também detectar uma elevada diversidade de cassetes de genes associadas a integrões, sendo possível que algumas dessas sequências codifiquem para proteínas que desempenhem um importante papel na adaptação bacteriana às intensas pressões selectivas características deste tipo de ambientes. Assim, é possível concluir que as comunidades bacterianas presentes em águas residuais reúnem diferentes tipos de elementos geneticamente móveis que desempenham um importante papel não só na adaptação bacteriana, mas também na disseminação de determinantes genéticos de resistência para ambientes naturais. Adicionalmente, a presença de potenciais proteínas com possíveis aplicações biotecnológicas reforça a importância das águas residuais como fontes de diversidade funcional. Este trabalho incluiu também a criação e implementação da base de dados INTEGRALL, desenvolvida com o intuito de congregar informação acerca de integrões e de uniformizar a nomenclatura de cassetes de genes.

Educação sexual em contexto escolar: uma intervenção contra a vulnerabilidade na vivência da sexualidade adolescente

A sexualidade estando presente desde o nascimento, na adolescência assume novo significado. Descobre-se o primeiro amor através de uma relação de intimidade e partilha de afectos, o corpo adquire um novo sentido, o grupo torna-se importante enquanto fonte de suporte, partilha de angústias e confiança, contribuindo para o desenvolvimento do adolescente. Na adolescência, perscrutam alguns factores de risco, nomeadamente a vivência da sexualidade de forma não informada e responsável, com repercussões para a saúde física e psicológica, pelo que é imperioso intervir através de programas formativos no âmbito da sexualidade que promovam vivência desta de forma responsável. São objectivos do estudo: Promover um modelo de intervenção formativa baseado no debate e reflexão crítica sobre sexualidade em contexto de sala de aula; Construir e validar instrumentos que permitam avaliar as atitudes face à sexualidade e ainda os conhecimentos dos adolescentes sobre reprodução, planeamento familiar e infecções de transmissão sexual; Testar a eficácia de um programa de intervenção formativo a nível dos conhecimentos sobre planeamento familiar, infecções de transmissão sexual, reprodução e atitudes face à sexualidade; Testar a efectividade do programa de intervenção formativo numa amostra alargada de adolescentes, analisando também o papel das variáveis sociodemográficas, sociopsicológicas e sexuais. O trabalho de campo desenvolveu-se em três estudos distintos, no primeiro e terceiro participaram 840 adolescentes e no segundo 90. No primeiro estudo construímos e validamos os instrumentos para colheita de dados, no segundo, experimental de campo, validamos o modelo da intervenção formativa no âmbito da sexualidade e no terceiro, descritivo e correlacional, testamos a efectividade de um programa de intervenção numa amostra mais alargada. O protocolo de recolha de informação incluiu quatro escalas construídas para o efeito com o intuito de avaliar as atitudes face à sexualidade, os conhecimentos sobre planeamento familiar, infecções de transmissão sexual e reprodução e ainda a escala de insatisfação com a imagem corporal em adolescentes e a escala de satisfação com o suporte social. As raparigas e residentes na zona urbana são as que têm mais conhecimentos sobre planeamento familiar e possuem atitudes face à sexualidade mais favoráveis. Os interlocutores preferenciais sobre sexualidade são os amigos, seguidos da mãe. São os adolescentes com pouca ou moderada prática religiosa que já iniciaram a actividade sexual. São as raparigas que têm maior satisfação com o suporte social nas dimensões, satisfação com as amizades, intimidade, actividades sociais e suporte social total. Os adolescentes que já iniciaram a actividade sexual, revelam maior percepção de suporte social na dimensão satisfação com a amizade. O modelo de formação construído e aplicado influenciou as atitudes face à sexualidade, conhecimentos sobre reprodução, sobre infecções de transmissão sexual e sobre planeamento familiar. Do nosso ponto de vista, pensamos ser urgente a aplicação de programas de intervenção formativos em contexto escolar, ou outro, que integrem de uma forma harmoniosa as várias facetas da sexualidade humana, promovendo a aquisição de uma postura responsável, flexível e gratificante nos adolescentes enquanto seres sexuados.

Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Phylogenetic and functional diversity of estuarine bacterioneuston

A micro-camada superficial da água (SML) é caracterizada pela ocorrência de grandes quantidades de compostos orgânicos, pela acumulação de contaminantes antropogênicos e é submetida a uma intensa radiação solar, extrema mudança de temperatura e, no caso dos estuários, flutuação de salinidade. Estas propriedades físico-químicas estão, provavelmente, a modular a comunidade bacteriana (bacterioneuston) com propriedades filogenéticas e funcionais específicas. Neste estudo, as abordagens dependentes e independentes do cultivo foram aplicadas para avaliar a estrutura e dinâmica das comunidades bacterioneuston e bacterioplâncton em três localizações geográficas ao longo do estuário da Ria de Aveiro. Além disso, comparámos a diversidade filogenética de grupos específicos (Aeromonas, Pseudomonas e Psychrobacter) presentes em bacterioneuston e bacterioplâncton. Finalmente, as duas comunidades foram comparadas em termos de prevalência e diversidade de bactérias resistentes aos antibióticos e respetivos genes de resistência. Bactérias heterotróficas cultiváveis foram enriquecidas em SML. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) permitiu a identificação de filotipos específicos em SML. Além disso, a análise de agrupamento dos perfis de DGGE de ambas as comunidades revelou uma ligeira tendência de agrupamento de acordo com a camada amostrada. As diferenças entre as duas comunidades variaram de acordo com factores espaciais e temporais. Em termos de diversidade filogenética de grupos específicos, não foram identificadas diferenças consistentes entre SML e UW com relação às comunidades de Aeromonas. Com relação ao género Pseudomonas, uma unidade operacional taxonómica cultivável foi consistentemente hiper-representada nas amostras de SML. Metodologias dependentes e independentes do cultivo revelaram a presença de populações de Psychrobacter complexas e muito estáveis em todos os sítios e datas de amostragens, com diferenças significativas entre as comunidades de Psychrobacter presentes em SML e UW. Estirpes representativas de prováveis novas espécies também foram cultivadas. Em termos de resistência aos antibióticos, a prevalência de bactérias resistentes em SML foi alta sugerindo selecção pelas condições presentes em SML. É preciso enfatizar que a resistência aos antibióticos foi incomum entre as bactérias estuarinas e os mecanismos de resistência foram, predominantemente, intrínsecos. Pela combinação de abordagens inovadoras dependentes e independentes do cultivo, este estudo forneceu novas e consistentes informações com relação às diferenças em ambas as comunidades bacterianas e em relação a alguns dos fatores que contribuem para a sua formação.

Natural substances and high pressure processing to preserve sea bass

Esta tese teve como objectivo estudar estratégias de conservação de pescado fresco, recorrendo ao uso de extractos e óleos essenciais de plantas e do processamento por alta pressão (HPP), usando filetes de robalo como um caso de estudo modelo. Relativamente aos extractos e óleos essenciais, avaliaram-se as suas propriedades antibacterianas e antioxidantes. Os extractos aquosos quente de poejo e de orégão e o óleo essencial de cravinho apresentaram a maior actividade antioxidante. Os óleos essenciais foram mais eficientes do que os extractos para inibir o crescimento das estirpes bacterianas testadas, tendo-se observado os menores valores de concentração mínima inibitória nos óleos essenciais de orégão, citronela, alho e orégão Espanhol. De seguida, estudou-se o efeito dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão na conservação de filetes de robalo fresco tendo em conta critérios microbiológicos, químicos, físicos e sensoriais. A aplicação do óleo essencial de orégão Espanhol aumentou o tempo de vida útil dos filetes sob o ponto de vista bacteriano, mas não em termos sensoriais. A combinação dos óleos essenciais de orégão Espanhol e de limão melhorou o efeito antioxidante e reduziu a intensidade do odor e a sua eficácia em relação às Enterobacteriaceae, comparando com o tratamento com óleo essencial de orégão Espanhol per se. No sentido de reduzir o odor conferido pelos óleos essenciais realizou-se um estudo de conservação para avaliar o efeito de películas com óleos essenciais (citronela, alho e tomilho) em filetes de robalo, recorrendo a uma teste de desafio bacteriano. As películas sem óleos essenciais aumentaram o tempo de vida útil sob o ponto de vista bacteriano, mas este efeito não foi observado com a incorporação dos óleos essenciais nas películas. Em relação ao HPP, testaram-se diversas condições (nível de pressão, tempo de pressurização e taxa de pressurização) e avaliaram-se os efeitos na actividade enzimática, na qualidade global e na conservação de filetes de robalo fresco. Em geral, o aumento do nível de pressão e do tempo de pressurização diminuiu a actividade da fosfatase ácida e das enzimas proteolíticas, a carga bacteriana e a capacidade de retenção de água, enquanto que os filetes ficaram mais brancos. O HPP revelou potencial para o desenvolvimento de novos produtos: mais brancos, não translúcidos, mais firmes e com maior tempo de frescura e estabilidade microbiológica. Em conclusão, os óleos essenciais e o HPP têm potencial para conservar pescado fresco, devido aos seus efeitos na qualidade bacteriana. Ainda assim, mais esforços devem ser feitos no sentido de reduzir a transferência de odor dos óleos essenciais para o pescado e os efeitos do HPP no aspecto do pescado e na oxidação lipídica.

UV-induced stress in bacterioneuston : mechanisms and ecological implications

As bactérias desempenham um papel chave na reciclagem de energia e matéria nas teias tróficas aquáticas. No entanto, as suas pequenas dimensões, curto tempo de geração e o facto de os seus genomas constituírem uma grande porção do seu volume celular, tornam as bactérias mais suscetíveis às alterações ambientais que os organismos superiores. O aumento dos níveis de radiação UVB (280-320 nm) constitui uma ameaça particularmente importante para as comunidades bacterianas dos sistemas aquáticos, uma vez que a radiação consegue penetrar até profundidades consideráveis. No entanto, os mecanismos através dos quais a radiação causa danos nas bactérias ainda não são claros, o que impede a modelação precisa dos efeitos da radiação UV nas comunidades bacterianas naturais. O bacterioneuston habita a microcamada superficial (primeiro milímetro da coluna de água), estando naturalmente exposto a níveis de radiação UV superiores aos que o bacterioplâncton está exposto. Deste modo, a microcamada superficial pode ser vista como um nicho ecológico modelo para estudar as interações entre as bactérias e a radiação UV. Os objetivos deste trabalho foram (i) avaliar a influência do nível de exposição natural à radiação das comunidades bacterianas na sua sensibilidade à radiação UV, através da comparação das respostas fotobiológicas do bacterioneuston e bacterioplâncton; (ii) aprofundar o conhecimento acerca dos mecanismos através dos quais a radiação UV causa danos, bem como dos fatores que afetam a interação entre a radiação UV e as bactérias; e (iii) avaliar o potencial da proteína RecA, que medeia a resposta SOS das bactérias, para ser usada como marcador de danos induzidos por UV nas comunidades bacterianas. Verificou-se que o bacterioneuston é mais resistente à radiação UVB que o bacterioplâncton e recupera de modo mais eficiente dos danos induzidos por UV, particularmente em condições de escassez de nutrientes, indicando assim que o nível de exposição natural das comunidades bacterianas à radiação afeta a sua sensibilidade à radiação UV. Os resultados das análises independentes do cultivo revelaram o potencial da radiação UV para afetar a estrutura das comunidades bacterianas ao selecionar bactérias resistentes. A análise do perfil de utilização de fontes de carbono usando o sistema de Ecoplacas Biolog ® e a determinação das taxas de incorporação de leucina e timidina permitiu também verificar que a radiação UV modifica o funcionamento das comunidades bacterianas. Os resultados obtidos indicam a possibilidade do bacterioneuston conter um conjunto de estirpes resistentes a UV que, mediante as condições meteorológicas apropriadas, podem ser selecionadas aquando da exposição à radiação.

Hydrological and photochemical influence on dynamics of estuarine bacteria

Os estuários são ecossistemas complexos, onde os processos físicos, químicos e biológicos estão intimamente ligados. A dinâmica bacteriana num estuário reflete a interação e a elevada variação temporal e espacial desses processos. Este trabalho teve como objetivo elucidar as interações entre os processos físicos, fotoquímicos e microbiológicos no sistema estuarino da Ria de Aveiro (Portugal). Para tal, foi realizada uma abordagem inicial no campo, durante a qual as comunidades bacterianas na coluna de água foram caracterizadas em termos de abundância e atividade ao longo de 2 anos. O estudo foi realizado em dois locais distintos, escolhidos por tipificarem as características marinhas e salobras do estuário. Estes locais possuem diferentes hidrodinâmicas, influências fluviais e, quantidade e composição de matéria orgânica. Numa perspectiva mecanicista, foram realizadas simulações laboratoriais no sentido de elucidar a resposta das bactérias à matéria orgânica foto-transformada. As comunidades bacterianas no estuário adaptam-se a diferentes regimes de água doce, desenvolvendo padrões de abundância e atividade distintos nas zonas marinha e salobra. Os elevados caudais dos rios induzem estratificação vertical na zona marinha, promovendo o fluxo de fitoplâncton do mar para o estuário, do bacterioplâncton do estuário para o mar, e estimulam a importação de bactérias aderentes a partículas na zona salobra. O transporte advectivo e os processos de ressuspensão contribuem para aumentar 3 vezes o número de bactérias aderentes a partículas durante os períodos de intensas descargas fluviais. Adicionalmente, a atividade bacteriana no estuário é controlada pela concentração de azoto inerente à variações de água doce. O fornecimento de azoto em associação com a fonte dos substratos bacterianos induzem alterações significativas na produtividade. O padrão de variação vertical de comunidades bacterianas foi distinto nas duas zonas do estuário. Na zona marinha, as bactérias na microcamada superficial (SML) apresentaram taxas de hidrólise mais elevadas, mas menores taxas de incorporação de monómeros e produção de biomassa que na água subjacente (UW), enquanto na zona salobra, as taxas de hidrólise e incorporação foram similares nos dois compartimentos, mas a produtividade foi significativamente mais elevada na SML. Apesar da abundância bacteriana ter sido semelhante na SML e UW, a fração de células aderentes a partículas foi significativamente maior na SML (2-3 vezes), em ambas as zonas do estuário. A integração dos resultados microbiológicos com as variáveis ambientais e hidrológicos mostraram que fortes correntes na zona marinha promovem a mistura vertical, inibindo o estabelecimento de uma comunidade bacteriana na SML distinta da UW. Em contraste, na zona de água salobra, a menor velocidades das correntes fornece as condições adequadas ao aumento da atividade bacteriana na SML. Características específicas do local, tais como a hidrodinâmica e as fontes e composição da matéria orgânica, conduzem também a diferentes graus de enriquecimento superficial de matéria orgânica e inorgânica, influenciando a sua transformação. Em geral, o ambiente da SML estuarina favorece a hidrólise de polímeros, mas inibe a utilização de monómeros, comparativamente com água subjacente. No entanto, as diferenças entre as duas comunidades tendem a atenuar-se com o aumento da atividade heterotrófica na zona salobra. A matéria orgânica dissolvida cromófora (CDOM) das duas zonas do estuário possui diferentes características espectrais, com maior aromaticidade e peso molecular médio (HMW) na zona de água salobra, em comparação com a zona marinha. Nesta zona, a abundância bacteriana correlacionou-se com a350 e a254, sugerindo uma contribuição indireta das bactéria para HMW CDOM. A irradiação do DOM resultou numa diminuição dos valores de a254 e a350, e, em um aumento do declive S275-295 e dos rácios E2:E3 (a250/a365) e SR. No entanto, a extensão de transformações foto-induzidas e as respostas microbianas são dependentes das características iniciais CDOM, inferidas a partir das suas propriedades ópticas. A dinâmica estuarina influencia claramente as atividades heterotróficas e a distribuição dos microorganismos na coluna de água. A entrada de água doce influencia a dinâmica e os principais reguladores das comunidades bacterianas no estuário. Os processos fotoquímicos e microbianos produzem alterações nas propriedades ópticas da CDOM e a combinação desses processos determina o resultado global e o destino da CDOM nos sistemas estuarinos com influência na produtividade nas áreas costeiras adjacente.

Oil hydrocarbon-bacteria interactions in coastal environments

The ability of microorganisms to use oil hydrocarbons as a source of carbon and energy is crucial for environmental oil detoxification. However, there is still a lack of knowledge on fundamental aspects of this process on specific habitats and under different climate scenarios. In the first phase of this work, the culturable fraction of the oil hydrocarbon (OH) degrading bacteria from the sea surface microlayer (SML) of the estuarine system Ria de Aveiro was characterized. In the second phase, the impact of oil contamination on the active bacterial community was studied under climate change scenarios. Pseudomonas emerged as the prevailing genera among OH degrading bacteria in the SML. Moreover, culture-independent methods revealed that the relative abundance and diversity of Gammaproteobacteria, in which Pseudomonas is included, varies along an estuarine gradient of contamination. In order to access the impact of oil contamination on microbial communities under climate change scenarios, an experimental life support system for microcosm experiments (ELLS) was developed and validated for simulation of climate change effects on microbial communities. With the ELSS it is possible to simulate, in controlled conditions, fundamental parameters of the dynamics of coastal and estuarine systems while maintaining community structure in terms of the abundance of the most relevant members of the indigenous bacterial community. A microcosm experiment in which the independent and combined impact of ultraviolet radiation, ocean acidification and oil contamination on microbial communities was conducted. The impact on bacterial communities was accessed with a 16S RNA (cDNA) based barcode pyrosequencing approach. There was a drastic decrease of Desulfobacterales relative abundance after oil contamination under the reduced pH value estimated for 2100, when compared to present values. Since members of this order are known OH degraders, such a significant decrease may have consequences on OH detoxification of contaminated environments under the pH levels of the ocean expected for the future. Metagenome predictions based on the 16S RNA database indicated that several degradation pathways of OH could be affected under oil contamination and reduced water pH. Taken together, the results from this work bring new information on the dynamics of OH degrading bacteria in coastal and estuarine environments under present and future climate scenarios.

Microbe-mediated recovery of salt marshes contaminated with oil hydrocarbons

Salt marshes are highly productive intertidal habitats that serve as nursery grounds for many commercially and economically important species. Because of their location and physical and biological characteristics, salt marshes are considered to be particularly vulnerable to anthropogenic inputs of oil hydrocarbons. Sediment contamination with oil is especially dangerous for salt marsh vegetation, since low molecular weight aromatic hydrocarbons can affect plants at all stages of development. However, the use of vegetation for bioremediation (phytoremediation), by removal or sequestration of contaminants, has been intensively studied. Phytoremediation is an efficient, inexpensive and environmental friendly approach for the removal of aromatic hydrocarbons, through direct incorporation by the plant and by the intervention of degrading microbial populations in the rhizosphere (microbe-assisted phytoremediation). Rhizosphere microbial communities are enriched in important catabolic genotypes for degradation of oil hydrocarbons (OH) which may have a potential for detoxification of the sediment surrounding the roots. In addition, since rhizosphere bacterial populations may also internalize into plant tissues (endophytes), rhizocompetent AH degrading populations may be important for in planta AH degradation and detoxification. The present study involved field work and microcosms experiments aiming the characterization of relevant plant-microbe interactions in oilimpacted salt marshes and the understanding of the effect of rhizosphere and endosphere bacteria in the role of salt marsh plants as potential phytoremediation agents. In the field approach, molecular tools were used to assess how plant species- and OH pollution affect sediment bacterial composition [bulk sediment and sediment surrounding the roots (rhizosphere) of Halimione portulacoides and Sarcocornia perennis subsp. perennis] in a temperate estuary (Ria de Aveiro, Portugal) chronically exposed to OH pollution. In addition, the 16S rRNA gene sequences retrieved in this study were used to generate in silico metagenomes and to evaluate the distribution of potential bacterial traits in different microhabitats. Moreover, a combination of culture-dependent and -independent approaches was used to investigate the effect of oil hydrocarbons contamination on the structure and function of endophytic bacterial communities of salt marsh plants.Root systems of H. portulacoides and S. perennis subsp. perennis appear to be able to exert a strong influence on bacterial composition and in silico metagenome analysis showed enrichment of genes involved in the process of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) degradation in the rhizosphere of halophyte plants. The culturable fraction of endophytic degraders was essentially closely related to known OH-degrading Pseudomonas species and endophytic communities revealed sitespecific effects related to the level of OH contamination in the sediment. In order to determine the effects of oil contamination on plant condition and on the responses in terms of structure and function of the bacterial community associated with plant roots (rhizosphere, endosphere), a microcosms approach was set up. The salt marsh plant Halimione portulacoides was inoculated with a previous isolated Pseudomonas sp. endophytic degrader and the 2-methylnaphthalene was used as model PAH contaminant. The results showed that H. portulacoides health and growth were not affected by the contamination with the tested concentration. Moreover, the decrease of 2-methylnaphthalene at the end of experiment, can suggest that H. portulacoides can be considered as a potential plant for future uses in phytoremedition approaches of contaminated salt marsh. The acceleration of hydrocarbon degradation by inoculation of the plants with the hydrocarbon-degrading Pseudomonas sp. could not, however, be demonstrated, although the effects of inoculation on the structure of the endophytic community observed at the end of the experiment indicate that the strain may be an efficient colonizer of H. portulacoides roots. The results obtained in this work suggest that H. portulacoides tolerates moderate concentrations of 2-methylnaphthalene and can be regarded as a promising agent for phytoremedition approaches in salt marshes contaminated with oil hydrocarbons. Plant/microbe interactions may have an important role in the degradation process, as plants support a diverse endophytic bacterial community, enriched in genetic factors (genes and plasmids) for hydrocarbon degradation.

Resistance to last-resort antibiotics in natural environments

Last-resort antibiotics are the final line of action for treating serious infections caused by multiresistant strains. Over the years the prevalence of resistant bacteria has been increasing. Natural environments are reservoirs of antibiotic resistance, highly influenced by human-driven activities. The importance of aquatic systems on the evolution of antibiotic resistance is highlighted from the assumption that clinically-relevant resistance genes have originated in strains ubiquitous in these environments. We hypothesize that: a) rivers are reservoirs and disseminators of antibiotic resistance; b) anthropogenic activities potentiate dissemination of resistance to last-resort antibiotics. Hence, the main goal of the work is to compare the last-resort antibiotics resistome, in polluted and unpolluted water. Rivers from the Vouga basin, exposed to different anthropogenic impacts, were sampled. Water quality parameters were determined to classify rivers as unpolluted or polluted. Two bacterial collections were established enclosing bacteria resistant to cefotaxime (3rd generation cephalosporin) and to imipenem (carbapenem). Each collection was characterized regarding: phylogenetic diversity, antibiotic susceptibility, resistance mechanisms and mobile genetic elements. The prevalence of cefotaxime- and imipenem-resistant bacteria was higher in polluted water. Results suggested an important role in the dissemination of antibiotic resistance for Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Aeromonas. The occurrence of bacteria resistant to non-beta-lactams was higher among isolates from polluted water as also the number of multiresistant strains. Among strains resistant to cefotaxime, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) genes were detected (predominantly blaCTX-M-like) associated to mobile genetic elements previously described in clinical strains. ESBL-producers were often multiresistant as a result of co-selection mechanisms. Culture-independent methods showed clear differences between blaCTX-M-like sequences found in unpolluted water (similar to ancestral genes) and polluted water (sequences identical to those reported in clinical settings). Carbapenem resistance was mostly related to the presence of intrinsically resistant bacteria. Yet, relevant carbapenemase genes were detected as blaOXA-48-like in Shewanella spp. (the putative origin of these genes), and blaVIM-2 in Pseudomonas spp. isolated from polluted rivers. Culture-independent methods showed an higher than the previously reported diversity of blaOXA-48-like genes in rivers. Overall, clear differences between polluted and unpolluted systems were observed, regarding prevalence, phylogenetic diversity and susceptibility profiles of resistant bacteria and occurrence of clinically relevant antibiotic resistance genes, thus validating our hypotheses. In this way, rivers act as disseminators of resistance genes, and anthropogenic activities potentiate horizontal gene transfer and promote the constitution of genetic platforms that combine several resistance determinants, leading to multiresistance phenotypes that may persist even in the absence of antibiotics.

Development of infrared spectroscopy for assessing bacterial quality in foods

Rapid and specific detection of foodborne bacteria that can cause food spoilage or illness associated to its consumption is an increasingly important task in food industry. Bacterial detection, identification, and classification are generally performed using traditional methods based on biochemical or serological tests and the molecular methods based on DNA or RNA fingerprints. However, these methodologies are expensive, time consuming and laborious. Infrared spectroscopy is a reliable, rapid, and economic technique which could be explored as a tool for bacterial analysis in the food industry. In this thesis it was evaluated the potential of IR spectroscopy to study the bacterial quality of foods. In Chapter 2, it was developed a calibration model that successfully allowed to predict the bacterial concentration of naturally contaminated cooked ham samples kept at refrigeration temperature during 8 days. In this part, it was developed the methodology that allowed the best reproducibility of spectra from bacteria colonies with minimal sample preparation, which was used in the subsequent work. Several attempts trying different resolutions and number of scans in the IR were made. A spectral resolution of 4 cm-1, with 32 scans were the settings that allowed the best results. Subsequently, in Chapter 3, it was made an attempt to identify 22 different foodborne bacterial genera/species using IR spectroscopy coupled with multivariate analysis. The principal component analysis, used as an exploratory technique, allowed to form distinct groups, each one corresponding to a different genus, in most of the cases. Then, a hierarchical cluster analysis was performed to further analyse the group formation and the possibility of distinction between species of the same bacterial genus. It was observed that IR spectroscopy not only is suitable to the distinction of the different genera, but also to differentiate species of the same genus, with the simultaneous use of principal component analysis and cluster analysis techniques. The utilization of IR spectroscopy and multivariate statistical analysis were also investigated in Chapter 4, in order to confirm the presence of Listeria monocytogenes and Salmonella spp. isolated from contaminated foods, after growth in selective medium. This would allow to substitute the traditional biochemical and serological methods that are used to confirm these pathogens and that delay the obtainment of the results up to 2 days. The obtained results allowed the distinction of 3 different Listeria species and the distinction of Salmonella spp. from other bacteria that can be mistaken with them. Finally, in chapter 5, high pressure processing, an emerging methodology that permits to produce microbiologically safe foods and extend their shelf-life, was applied to 12 foodborne bacteria to determine their resistance and the effects of pressure in cells. A treatment of 300 MPa, during 15 minutes at room temperature was applied. Gram-negative bacteria were inactivated to undetectable levels and Gram-positive showed different resistances. Bacillus cereus and Staphylococcus aureus decreased only 2 logs and Listeria innocua decreased about 5 logs. IR spectroscopy was performed in bacterial colonies before and after HPP in order to investigate the alterations of the cellular compounds. It was found that high pressure alters bands assigned to some cellular components as proteins, lipids, oligopolysaccharides, phosphate groups from the cell wall and nucleic acids, suggesting disruption of the cell envelopes. In this work, bacterial quantification and classification, as well as assessment of cellular compounds modification with high pressure processing were successfully performed. Taking this into account, it was showed that IR spectroscopy is a very promising technique to analyse bacteria in a simple and inexpensive manner.

Effect of photodynamic therapy on the virulence factors of Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus are Gram-positive bacteria who integrate the human microbiota. Nevertheless, these bacteria can be pathogenic to the humans. Due to the increasing occurrence of antibiotic-resistant S. aureus new approaches to control this pathogen are necessary. The antimicrobial photodynamic inactivation process (PDI) is based in the combined use of a light source, an oxidizing agent like oxygen and an intermediary agent (a photosensitizer). These three components interact to form cytotoxic reactive oxygen species that irreversibly damage vital constituents of the microbial cells and ultimately lead to cell death. In fact, PDI is being shown to be a promising alternative to the antibiotic approach in the inactivation of pathogenic microorganisms. However, information on effects of photosensitization on particular virulence factors is strikingly scarce. The objective of this work was to evaluate the effect of PDI on virulence factors of S. aureus. For this, as photosensitizer the 5,10,15,20-tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrin tetra-iodide (Tetra-Py+-Me) and six strains of S. aureus (one reference strain, one strain with 1 enterotoxin, two strains with 3 enterotoxins and two strains resistant to methicillin, MRSA – one with 5 enterotoxins and the other without enterotoxins) were used. The effect of photosensitization on catalase activity, beta hemolysis, lipases, thermonuclease, enterotoxins, coagulase production and resistance to methicillin was assessed. The results indicate that the expression of some virulence factors in the cells subjected to this therapy is affected. Additionally the susceptibility of the strains to PDI did not decrease upon successive treatments.

Infection mechanism of Diplodia corticola

Diplodia corticola is regarded as the most virulent fungus involved in cork oak decline, being able to infect not only Quercus species (mainly Q. suber and Q. ilex), but also grapevines (Vitis vinifera) and eucalypts (Eucalyptus sp.). This endophytic fungus is also a pathogen whose virulence usually manifests with the onset of plant stress. Considering that the infection normally culminates in host death, there is a growing ecologic and socio-economic concern about D. corticola propagation. The molecular mechanisms of infection are hitherto largely unknown. Accordingly, the aim of this study was to unveil potential virulence effectors implicated in D. corticola infection. This knowledge is fundamental to outline the molecular framework that permits the fungal invasion and proliferation in plant hosts, causing disease. Since the effectors deployed are mostly proteins, we adopted a proteomic approach. We performed in planta pathogenicity tests to select two D. corticola strains with distinct virulence degrees for our studies. Like other filamentous fungi D. corticola secretes protein at low concentrations in vitro in the presence of high levels of polysaccharides, two characteristics that hamper the fungal secretome analysis. Therefore, we first compared several methods of extracellular protein extraction to assess their performance and compatibility with 1D and 2D electrophoretic separation. TCA-Acetone and TCA-phenol protein precipitation were the most efficient methods and the former was adopted for further studies. The proteins were extracted and separated by 2D-PAGE, proteins were digested with trypsin and the resulting peptides were further analysed by MS/MS. Their identification was performed by de novo sequencing and/or MASCOT search. We were able to identify 80 extracellular and 162 intracellular proteins, a milestone for the Botryosphaeriaceae family that contains only one member with the proteome characterized. We also performed an extensive comparative 2D gel analysis to highlight the differentially expressed proteins during the host mimicry. Moreover, we compared the protein profiles of the two strains with different degrees of virulence. In short, we characterized for the first time the secretome and proteome of D. corticola. The obtained results contribute to the elucidation of some aspects of the biology of the fungus. The avirulent strain contains an assortment of proteins that facilitate the adaptation to diverse substrates and the identified proteins suggest that the fungus degrades the host tissues through Fenton reactions. On the other hand, the virulent strain seems to have adapted its secretome to the host characteristics. Furthermore, the results indicate that this strain metabolizes aminobutyric acid, a molecule that might be the triggering factor of the transition from a latent to a pathogenic state. Lastly, the secretome includes potential pathogenicity effectors, such as deuterolysin (peptidase M35) and cerato-platanin, proteins that might play an active role in the phytopathogenic lifestyle of the fungus. Overall, our results suggest that D. corticola has a hemibiotrophic lifestyle, switching from a biotrophic to a necrotrophic interaction after plant physiologic disturbances.This understanding is essential for further development of effective plant protection measures.